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En la última década, la tecnología de secuenciación genética se ha utilizado ampliamente en la investigación y la práctica clínica del cáncer, convirtiéndose en una herramienta clave para revelar las características moleculares del cáncer. Los avances en el diagnóstico molecular y la terapia dirigida han impulsado el desarrollo de conceptos de terapia de precisión tumoral y han supuesto una gran transformación en todo el campo del diagnóstico y el tratamiento de tumores. Las pruebas genéticas pueden utilizarse para advertir sobre el riesgo de cáncer, orientar las decisiones de tratamiento y evaluar el pronóstico, y constituyen una herramienta clave para mejorar los resultados clínicos de los pacientes. A continuación, resumimos los artículos recientes publicados en CA Cancer J Clin, JCO, Ann Oncol y otras revistas para revisar la aplicación de las pruebas genéticas en el diagnóstico y el tratamiento del cáncer.

Mutaciones somáticas y mutaciones de la línea germinal. En general, el cáncer es causado por mutaciones del ADN que pueden heredarse de los padres (mutaciones de la línea germinal) o adquirirse con la edad (mutaciones somáticas). Las mutaciones de la línea germinal están presentes desde el nacimiento, y el mutador generalmente porta la mutación en el ADN de cada célula del cuerpo y puede transmitirse a la descendencia. Las mutaciones somáticas son adquiridas por individuos en células no gaméticas y generalmente no se transmiten a la descendencia. Tanto las mutaciones de la línea germinal como las somáticas pueden destruir la actividad funcional normal de las células y conducir a la transformación maligna de las células. Las mutaciones somáticas son un factor clave de malignidad y el biomarcador más predictivo en oncología; sin embargo, aproximadamente el 10 al 20 por ciento de los pacientes con tumores son portadores de mutaciones de la línea germinal que aumentan significativamente su riesgo de cáncer, y algunas de estas mutaciones también son terapéuticas.
Mutación conductora y mutación pasajera. No todas las variantes del ADN afectan la función celular; en promedio, se necesitan de cinco a diez eventos genómicos, conocidos como "mutaciones conductoras", para desencadenar la degeneración celular normal. Las mutaciones conductoras a menudo ocurren en genes estrechamente relacionados con las actividades vitales celulares, como los genes involucrados en la regulación del crecimiento celular, la reparación del ADN, el control del ciclo celular y otros procesos vitales, y tienen el potencial de ser utilizados como dianas terapéuticas. Sin embargo, el número total de mutaciones en cualquier cáncer es bastante grande, desde unos pocos miles en algunos cánceres de mama hasta más de 100.000 en algunos cánceres colorrectales y de endometrio altamente variables. La mayoría de las mutaciones tienen poca o ninguna significación biológica, incluso si la mutación ocurre en la región codificante, estos eventos mutacionales insignificantes se denominan "mutaciones pasajeras". Si una variante genética en un tipo de tumor particular predice su respuesta o resistencia al tratamiento, la variante se considera clínicamente operable.
Oncogenes y genes supresores de tumores. Los genes que mutan con frecuencia en el cáncer se pueden dividir, a grandes rasgos, en dos categorías: oncogenes y genes supresores de tumores. En las células normales, la proteína codificada por los oncogenes desempeña principalmente la función de promover la proliferación celular e inhibir la apoptosis celular, mientras que la proteína codificada por los genes oncosupresores es la principal responsable de regular negativamente la división celular para mantener la función celular normal. En el proceso de transformación maligna, la mutación genómica provoca el aumento de la actividad de los oncogenes y la disminución o pérdida de la actividad de los genes oncosupresores.
Variación pequeña y variación estructural. Estos son los dos tipos principales de mutaciones en el genoma. Las variantes pequeñas alteran el ADN al cambiar, eliminar o agregar un pequeño número de bases, incluyendo la inserción de bases, deleción, cambio de marco de lectura, pérdida del codón de inicio, mutaciones de pérdida del codón de parada, etc. La variación estructural es un reordenamiento amplio del genoma, que involucra segmentos génicos que varían en tamaño desde unos pocos miles de bases hasta la mayoría del cromosoma, incluyendo cambios en el número de copias de genes, deleción cromosómica, duplicación, inversión o translocación. Estas mutaciones pueden causar una reducción o mejora de la función de la proteína. Además de los cambios a nivel de genes individuales, las firmas genómicas también forman parte de los informes de secuenciación clínica. Las firmas genómicas pueden verse como patrones complejos de variaciones pequeñas y/o estructurales, incluyendo la carga de mutación tumoral (TMB), la inestabilidad de microsatélites (MSI) y los defectos de recombinación homóloga.

Mutación clonal y mutación subclonal. Las mutaciones clonales están presentes en todas las células tumorales, se presentan al momento del diagnóstico y persisten tras el avance del tratamiento. Por lo tanto, las mutaciones clonales tienen el potencial de utilizarse como dianas terapéuticas tumorales. Las mutaciones subclonales están presentes solo en un subconjunto de células cancerosas y pueden detectarse al inicio del diagnóstico, pero desaparecen con la recurrencia posterior o aparecen solo después del tratamiento. La heterogeneidad del cáncer se refiere a la presencia de múltiples mutaciones subclonales en un mismo cáncer. Cabe destacar que la gran mayoría de las mutaciones conductoras clínicamente significativas en todas las especies de cáncer comunes son mutaciones clonales y se mantienen estables durante la progresión del cáncer. La resistencia, a menudo mediada por subclones, puede no detectarse al momento del diagnóstico, pero aparece cuando recae después del tratamiento.

La técnica tradicional FISH o cariotipo celular se utiliza para detectar cambios a nivel cromosómico. La FISH permite detectar fusiones, deleciones y amplificaciones génicas, y se considera el método de referencia para la detección de dichas variantes, con alta precisión y sensibilidad, pero un rendimiento limitado. En algunas neoplasias hematológicas, especialmente la leucemia aguda, el cariotipo aún se utiliza para orientar el diagnóstico y el pronóstico, pero esta técnica está siendo reemplazada gradualmente por ensayos moleculares específicos como la FISH, la secuenciación del genoma completo (WGS) y la secuenciación de nueva generación (NGS).
Los cambios en genes individuales pueden detectarse mediante PCR, tanto en tiempo real como por PCR digital. Estas técnicas presentan una alta sensibilidad, son especialmente adecuadas para la detección y el seguimiento de pequeñas lesiones residuales y permiten obtener resultados en un tiempo relativamente corto. La desventaja es que el rango de detección es limitado (normalmente solo detecta mutaciones en uno o pocos genes) y la posibilidad de realizar múltiples pruebas es limitada.
La inmunohistoquímica (IHC) es una herramienta de monitorización basada en proteínas que se utiliza habitualmente para detectar la expresión de biomarcadores como ERBB2 (HER2) y los receptores de estrógeno. La IHC también puede utilizarse para detectar proteínas mutadas específicas (como BRAF V600E) y fusiones génicas específicas (como las fusiones de ALK). La ventaja de la IHC es que se integra fácilmente en el proceso rutinario de análisis tisular, lo que permite combinarla con otras pruebas. Además, la IHC puede proporcionar información sobre la localización subcelular de proteínas. Las desventajas son su limitada escalabilidad y las elevadas exigencias organizativas.
Secuenciación de segunda generación (NGS). La NGS utiliza técnicas de secuenciación paralela de alto rendimiento para detectar variaciones a nivel de ADN y/o ARN. Esta técnica permite secuenciar tanto el genoma completo (WGS) como las regiones génicas de interés. La WGS proporciona la información genómica más completa sobre mutaciones, pero su aplicación clínica presenta numerosos obstáculos, como la necesidad de muestras frescas de tejido tumoral (la WGS aún no es adecuada para analizar muestras inmovilizadas en formalina) y su elevado coste.
La secuenciación NGS dirigida incluye la secuenciación de exones completos y un panel de genes diana. Estas pruebas enriquecen las regiones de interés mediante sondas de ADN o amplificación por PCR, lo que limita la cantidad de secuenciación necesaria (el exoma completo constituye entre el 1 y el 2 % del genoma, e incluso paneles grandes con 500 genes constituyen solo el 0,1 % del genoma). Si bien la secuenciación de exones completos funciona bien en tejidos fijados con formalina, su coste sigue siendo elevado. Las combinaciones de genes diana son relativamente económicas y permiten flexibilidad en la selección de los genes que se analizarán. Además, el ADN libre circulante (cfDNA) está surgiendo como una nueva opción para el análisis genómico de pacientes con cáncer, conocido como biopsia líquida. Tanto las células cancerosas como las normales pueden liberar ADN al torrente sanguíneo, y el ADN liberado por las células cancerosas se denomina ADN tumoral circulante (ctDNA), que puede analizarse para detectar posibles mutaciones en las células tumorales.
La elección de la prueba depende del problema clínico específico que se vaya a abordar. La mayoría de los biomarcadores asociados a terapias aprobadas pueden detectarse mediante técnicas de FISH, IHC y PCR. Estos métodos son adecuados para la detección de pequeñas cantidades de biomarcadores, pero no mejoran la eficiencia de la detección con un aumento del rendimiento, y si se detectan demasiados biomarcadores, podría no haber suficiente tejido para la detección. En algunos cánceres específicos, como el cáncer de pulmón, donde es difícil obtener muestras de tejido y existen múltiples biomarcadores para analizar, la NGS es una mejor opción. En conclusión, la elección del ensayo depende del número de biomarcadores que se analizarán en cada paciente y del número de pacientes a los que se les realizará la prueba. En algunos casos, el uso de IHC/FISH es suficiente, especialmente cuando se ha identificado la diana, como en la detección de receptores de estrógeno, receptores de progesterona y ERBB2 en pacientes con cáncer de mama. Si se requiere una exploración más exhaustiva de las mutaciones genómicas y la búsqueda de posibles dianas terapéuticas, la NGS es más organizada y rentable. Además, la NGS puede considerarse en casos donde los resultados de IHC/FISH sean ambiguos o no concluyentes.

Diferentes directrices orientan sobre qué pacientes deberían ser elegibles para pruebas genéticas. En 2020, el Grupo de Trabajo de Medicina de Precisión de la ESMO emitió las primeras recomendaciones sobre pruebas NGS para pacientes con cáncer avanzado, recomendando la realización rutinaria de pruebas NGS para muestras tumorales de cáncer de pulmón no microcítico no escamoso avanzado, cáncer de próstata, cáncer colorrectal, cáncer de vías biliares y cáncer de ovario. En 2024, la ESMO actualizó sus recomendaciones sobre esta base, recomendando la inclusión del cáncer de mama y tumores raros, como tumores del estroma gastrointestinal, sarcomas, cánceres de tiroides y cánceres de origen desconocido.
En 2022, la Opinión Clínica de la ASCO sobre las pruebas genómicas somáticas en pacientes con cáncer metastásico o avanzado establece que, si se aprueba una terapia relacionada con biomarcadores en pacientes con tumores sólidos metastásicos o avanzados, se recomienda realizar pruebas genéticas a estos pacientes. Por ejemplo, se deben realizar pruebas genómicas en pacientes con melanoma metastásico para detectar mutaciones BRAF V600E, ya que los inhibidores de RAF y MEK están aprobados para esta indicación. Además, también se deben realizar pruebas genéticas si existe un marcador claro de resistencia al fármaco que se administrará al paciente. Egfrmab, por ejemplo, es ineficaz en el cáncer colorrectal con mutación KRAS. Al considerar la idoneidad de un paciente para la secuenciación genética, se deben integrar su estado físico, sus comorbilidades y el estadio tumoral, ya que los pasos necesarios para la secuenciación genómica, como el consentimiento del paciente, el procesamiento en el laboratorio y el análisis de los resultados, requieren que el paciente tenga una capacidad física y una esperanza de vida adecuadas.
Además de las mutaciones somáticas, algunos cánceres también deben analizarse para detectar genes de la línea germinal. Las pruebas de mutaciones de la línea germinal pueden influir en las decisiones de tratamiento para cánceres como las mutaciones BRCA1 y BRCA2 en los cánceres de mama, ovario, próstata y páncreas. Las mutaciones de la línea germinal también pueden tener implicaciones para la detección y prevención del cáncer en pacientes en el futuro. Los pacientes que son potencialmente aptos para las pruebas de mutaciones de la línea germinal deben cumplir ciertas condiciones, que incluyen factores como antecedentes familiares de cáncer, edad en el momento del diagnóstico y tipo de cáncer. Sin embargo, muchos pacientes (hasta el 50%) portadores de mutaciones patógenas en la línea germinal no cumplen los criterios tradicionales para las pruebas de mutaciones de la línea germinal basadas en los antecedentes familiares. Por lo tanto, para maximizar la identificación de portadores de mutaciones, la National Comprehensive Cancer Network (NCCN) recomienda que todos o la mayoría de los pacientes con cáncer de mama, ovario, endometrio, páncreas, colorrectal o próstata se realicen pruebas de mutaciones de la línea germinal.
En cuanto al momento de realizar las pruebas genéticas, dado que la gran mayoría de las mutaciones impulsoras clínicamente significativas son clonales y relativamente estables a lo largo de la progresión del cáncer, es razonable realizar pruebas genéticas a los pacientes en el momento del diagnóstico de cáncer avanzado. Para las pruebas genéticas posteriores, especialmente después de la terapia molecular dirigida, la prueba de ADNct es más ventajosa que el ADN del tejido tumoral, ya que el ADN sanguíneo puede contener ADN de todas las lesiones tumorales, lo que facilita la obtención de información sobre la heterogeneidad tumoral.
El análisis de ctADN después del tratamiento puede predecir la respuesta tumoral al mismo e identificar la progresión de la enfermedad antes que con los métodos de imagen estándar. Sin embargo, no se han establecido protocolos para utilizar estos datos como guía para las decisiones de tratamiento, y el análisis de ctADN no se recomienda a menos que se realice en ensayos clínicos. El ctADN también puede utilizarse para evaluar pequeñas lesiones residuales tras la cirugía radical de tumores. La prueba de ctADN después de la cirugía es un potente predictor de la progresión posterior de la enfermedad y puede ayudar a determinar si un paciente se beneficiará de la quimioterapia adyuvante; sin embargo, aún no se recomienda su uso fuera de ensayos clínicos para guiar las decisiones sobre quimioterapia adyuvante.

Procesamiento de datos. El primer paso en la secuenciación genómica consiste en extraer ADN de muestras de pacientes, preparar bibliotecas y generar datos de secuenciación sin procesar. Estos datos sin procesar requieren un procesamiento posterior, que incluye el filtrado de datos de baja calidad, su comparación con el genoma de referencia, la identificación de diferentes tipos de mutaciones mediante distintos algoritmos analíticos, la determinación del efecto de estas mutaciones en la traducción de proteínas y el filtrado de mutaciones de la línea germinal.
La anotación de genes conductores está diseñada para distinguir entre mutaciones conductoras y pasajeras. Las mutaciones conductoras provocan la pérdida o el aumento de la actividad de los genes supresores de tumores. Las variantes pequeñas que provocan la inactivación de genes supresores de tumores incluyen mutaciones sin sentido, mutaciones por desplazamiento del marco de lectura y mutaciones en sitios clave de empalme, así como deleciones menos frecuentes de codones de inicio y de terminación, y una amplia gama de mutaciones de inserción/deleción de intrones. Además, las mutaciones sin sentido y las pequeñas mutaciones de inserción/deleción de intrones también pueden provocar la pérdida de la actividad de los genes supresores de tumores al afectar dominios funcionales importantes. Las variantes estructurales que provocan la pérdida de la actividad de los genes supresores de tumores incluyen la deleción parcial o completa de genes y otras variantes genómicas que provocan la destrucción del marco de lectura del gen. Las variantes pequeñas que mejoran la función de los oncogenes incluyen mutaciones sin sentido e inserciones/deleciones ocasionales de intrones que afectan a dominios funcionales proteicos importantes. En casos raros, el truncamiento de proteínas o las mutaciones en el sitio de empalme pueden provocar la activación de oncogenes. Las variaciones estructurales que conducen a la activación de oncogenes incluyen la fusión, la deleción y la duplicación génicas.
La interpretación clínica de la variación genómica evalúa la relevancia clínica de las mutaciones identificadas, es decir, su potencial valor diagnóstico, pronóstico o terapéutico. Existen varios sistemas de clasificación basados ​​en la evidencia que pueden utilizarse para guiar la interpretación clínica de la variación genómica.
La Base de Datos de Oncología de Medicina de Precisión (OncoKB) del Centro Oncológico Memorial Sloan-Kettering clasifica las variantes genéticas en cuatro niveles según su valor predictivo para el uso de fármacos: Nivel 1/2: biomarcadores aprobados por la FDA o clínicamente estándar que predicen la respuesta de una indicación específica a un fármaco aprobado; Nivel 3: biomarcadores aprobados o no aprobados por la FDA que predicen la respuesta a nuevos fármacos dirigidos que han demostrado resultados prometedores en ensayos clínicos; y Nivel 4: biomarcadores no aprobados por la FDA que predicen la respuesta a nuevos fármacos dirigidos que han demostrado evidencia biológica convincente en ensayos clínicos. Se añadió un quinto subgrupo asociado con la resistencia al tratamiento.
Las directrices de la Sociedad Americana de Patología Molecular (AMP), la Sociedad Americana de Oncología Clínica (ASCO) y el Colegio Americano de Patólogos (CAP) para la interpretación de la variación somática la dividen en cuatro categorías: Grado I, con gran relevancia clínica; Grado II, con posible relevancia clínica; Grado III, con relevancia clínica desconocida; Grado IV, sin relevancia clínica conocida. Solo las variantes de grado I y II son relevantes para la toma de decisiones terapéuticas.
La Escala de Operabilidad Clínica de Dianas Moleculares (ESCAT) de la ESMO clasifica las variantes genéticas en seis niveles: Nivel I: dianas aptas para uso rutinario; Fase II: una diana aún en estudio, que probablemente se utilizará para evaluar a la población de pacientes que podría beneficiarse del fármaco diana, pero se necesitan más datos que la respalden; Grado III: variantes genéticas diana que han demostrado beneficio clínico en otras especies de cáncer; Grado IV: solo variantes genéticas diana respaldadas por evidencia preclínica; Grado V: existe evidencia que respalda la relevancia clínica de actuar sobre la mutación, pero la monoterapia contra la diana no prolonga la supervivencia, o se puede adoptar una estrategia de tratamiento combinado; Grado X: sin valor clínico.